一.导言

生物学特性

霍乱弧菌为革兰氏阴性细菌，呈弧形或逗号状，无芽孢和菌毛。有些菌株有荚膜，一端有又粗又长的鞭毛，而且很活跃。以霍乱病人的大米泔水样粪便为活菌悬液滴观察，可见细菌运动极为活泼，呈梭形或流星状运动。显微镜下，液体培养液滴染色，可见“鱼群”状排列的弧菌。人工培养后容易失去弧形，变成杆状。

对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在pH 8-2范围内均可生长，耐碱，在pH 8-0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因为其他细菌在这个pH值下不易生长，所以碱性蛋白胨水可以作为霍乱弧菌选择性增殖的培养基。

碱性平板上菌落直径2mm，圆形，光滑透明。霍乱弧菌对热、干燥、阳光、化学消毒剂和酸非常敏感，能耐受低温:湿热55℃15分钟，100℃1-2分钟，水中加0.5ppm氯15分钟即可杀灭；0.1%高锰酸钾浸泡蔬菜、水果可达到消毒的目的；在正常胃酸中仅存活4分钟。霍乱弧菌是一种需氧或兼性厌氧菌，可在16-44℃生长，最适生长温度为37℃。

流行病学特征

霍乱弧菌是霍乱的病原，是一种急性、烈性肠道传染病，以严重呕吐、腹泻、失水为特征，起病急，传染性强，死亡率高，属于国际检疫传染病。有139个血清群，其中O1和O139可引起霍乱。霍乱弧菌O1和O139是霍乱(一种严重的肠道传染病)的病原体。在自然情况下，人类容易感染霍乱弧菌。人们通过摄入被霍乱弧菌污染的食物或水引发霍乱。进入肠道的霍乱弧菌通过鞭毛穿过肠粘膜表面的粘液层，接近肠粘膜上皮细胞，被普通菌毛定殖。肠道环境有利于霍乱弧菌的繁殖，产生霍乱肠毒素，导致疾病的发生。

霍乱弧菌的主要致病因子是霍乱毒素(CT)。CT是目前已知最强的腹泻毒素，可引起大量肠液分泌，导致严重的呕吐和腹泻，体内大量水分和电介质流失，产生严重的水样腹泻综合征。霍乱弧菌引起的主要病变是严重脱水，临床上表现为指纹干瘪，皮下组织和肌肉干瘪。心、肝、脾等器官全部被缩小。内脏浆膜暗淡。肠腔高度扩张，肠内充满泔水样液体，肠黏膜松弛，但黏膜上皮完整，无溃疡。胆囊充满了粘稠的胆汁。以及肾小球间质毛细血管扩张、肾小管肿胀、变性和坏死。其他器官也有出血、变性等变化。

二、检查流程

参考标准为SN/T 1022—2010《进出口食品中霍乱弧菌检验方法》。本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的检验方法，适用于食品中霍乱弧菌的检验。动物饲料等食品生产加工领域环境样品中霍乱弧菌的检验可借鉴。

霍乱弧菌检验程序如图1所示:

图1

媒介识别和结果判断

①TCBS培养基

原理:蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠能刺激弧菌的生长；蔗糖是一种可发酵的糖；胆酸钠、牛胆汁粉、硫代硫酸钠、柠檬酸钠和较高的pH值能抑制革兰氏阳性菌和大肠杆菌。硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴百里酚蓝和百里酚蓝是pH指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

用法:称取本品89克，煮沸后溶于1000毫升蒸馏水中。冷却至45-50℃时，倒入无菌盘中备用。注意:不需要高压灭菌。

结果:TCBS上的霍乱弧菌呈圆形、光滑、黄色，直径2mm～3mm。具体测试结果如图2所示:

图2霍乱弧菌在非01 TCBS培养基中的生长结果

②庆大霉素琼脂培养基

原理:蛋白胨、牛肉粉可以提供氮源、维生素、矿物质、生长因子；提供蔗糖作为碳源；即利用氯化钠满足霍乱弧菌嗜盐生长的要求，同时形成不利于其他细菌生长的高渗透压。亚硫酸钠能刺激弧菌生长；庆大霉素、亚碲酸钾和较高的pH值能抑制革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌的生长。柠檬酸钠可以保护霍乱弧菌免受其他抗菌物质的侵害。霍乱弧菌对酸性环境敏感，所以这个pH值可以促进其生长；琼脂是培养基的凝固剂。

用法:称取本品50克，加热搅拌溶解于1000毫升蒸馏水中，待冷却至50℃左右，加入0.5毫升无菌1%亚碲酸钾溶液，混匀，倒入无菌盘中备用。不需要高压灭菌。

结果:霍乱弧菌在庆大霉素琼脂培养基上呈微蓝灰色、半透明、扁平、微凸起。如果长时间培养或室温放置，黑色金属碲会沉淀在菌落中心。具体测试结果如图3所示:

菌落略呈蓝灰色，半透明，扁平，略凸起。

延长培养时间后，菌落中心形成黑色金属碲沉淀。

③氯化钠三糖铁琼脂

原理:蛋白胨、牛肉粉、酵母粉提供碳氮源、维生素和矿物质；乳糖、葡萄糖和蔗糖是可发酵的糖。当它们分解产生酸时，用酚红酸碱指示剂测定。酸性是黄色，碱性是红色。有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应生成黑色的硫化亚铁沉淀。较高含量的氯化钠会促进弧菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂。

用法:称取本品65克，加入1000毫升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于试管中，121℃高压灭菌15分钟备用。

结果:霍乱弧菌在氯化钠三糖铁斜面上反应，底部为黄色，斜面为黄色，不产生硫化氢和气体。具体测试结果如图4所示:

④氯化钠营养琼脂

原理:蛋白胨和牛肉粉能为微生物生长提供碳氮源、维生素和生长因子；高含量的氯化钠可促进霍乱弧菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂。

用法:称取本品30克，加热溶解于1000毫升蒸馏水中，分装于三角瓶中或试管中，121℃灭菌15分钟。

结果:霍乱弧菌在氯化钠营养琼脂培养基上纯化培养后的菌落呈圆形，边缘半透明，中心不透明，直径约3mm。具体测试结果如图5所示:

生化鉴定和结果判断

①革兰氏染色

所用试剂:革兰氏染色试剂盒。

原理:结晶紫初染和碘溶液媒染后，细胞壁内形成不溶于水的结晶紫与碘的络合物。革兰氏阳性菌，由于细胞壁厚，肽聚糖网络多层，交联密集，用乙醇或丙酮脱色时，会因失水而使网眼缩小。此外，它不含脂类，因此结晶紫和碘的复合物可以牢固地留在壁中并保持紫色。但由于细胞壁薄，外膜脂质含量高，肽聚糖层薄，交联度差，以脂质为主的革兰氏阴性菌外膜在接触脱色剂时迅速溶解，薄而疏松的肽聚糖网络不能阻止结晶紫与碘的复合物的溶解，所以用乙醇脱色后仍无色，再用沙黄等红色染料染红，使革兰氏阴性菌呈红色。

结果:霍乱弧菌为革兰氏阴性细菌，呈弧形或弯曲状。染色结果如图6所示:

②氧化酶试验

所用试剂:氧化酶试纸。

原理:氧化酶，即细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系的末端呼吸酶。氧化酶先氧化细胞色素C，然后这个氧化的细胞色素C氧化对苯二胺产生显色反应。用细玻璃棒或一次性接种针挑取单菌落，涂于试纸上。30s内变成蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。

结果:选择营养琼脂上培养的单菌落进行氧化酶试验，霍乱弧菌氧化酶阳性。测试结果如图7所示:

③生化识别试纸条试验

所用试剂:青岛海博HBI霍乱弧菌生化鉴定试纸(SN)。

试剂介绍:用于霍乱弧菌的生化鉴定。成分:ONPG、脲酶、明胶、精氨酸双酶肉汤、鸟氨酸脱羧酶肉汤、赖氨酸脱羧酶肉汤、氨基酸脱羧酶对照、无盐胰蛋白胨水、2%氯化钠胰蛋白胨水、6%氯化钠胰蛋白胨水、8%氯化钠胰蛋白胨水、10%氯化钠胰蛋白胨水、靛蓝基质、1%氯化钠乳糖、1%氯化钠纤维二糖、1 (SN标准)。

操作:取装有2ml无菌生理盐水的试管，用接种针从氯化钠营养琼脂平板上挑取部分菌落，放入无菌生理盐水中，仔细研磨，制成0.5麦克米伦浊度的均匀菌悬液，取无污染生化鉴定条，每孔加入100ul菌悬液，其中固体和半固体生化管穿刺接种，鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸和氨基酸对照需用无菌石蜡覆盖。接种后做好标记，盖好盖子，放入底座中，置于36℃±1℃培养(42℃生长，42℃培养)。培养结束后，记录测试结果。具体测试结果如图8所示:

非01型霍乱弧菌生化鉴定结果

生化项目

结果判断

生化形状

生化项目

结果判断

生化形状

邻-硝基苯-β-d-半乳糖苷

+

黄色

8%氯化钠蛋白胨水

﹣

没有增长

脲酶

﹣

黄色

10%氯化钠蛋白胨水

﹣

没有增长

凝胶

+

液态

1%氯化钠甘露醇

+

红色

鸟氨酸

+

紫色

1%氯化钠乳糖

﹣

不变颜色

赖氨酸

+

紫色

1%氯化钠纤维二糖

﹣

不变颜色

氨基酸控制

﹣

黄色

1%氯化钠阿拉伯糖

﹣

不变颜色

精氨酸

﹣

黄色

1%氯化钠蔗糖

+

红色

无盐蛋白胨水

+

变得浑浊

靛蓝矩阵

+

红色戒指

2%氯化钠蛋白胨水

+

变得浑浊

40℃下的生长试验

+

变得浑浊

6%氯化钠蛋白胨水

﹣

没有增长

氧化酶

+

紫色

注:+表示阳性；-没有。

注意事项:1。靛蓝基质试验过程中，应在培养结束后加入2-4滴Kovacs靛蓝基质试剂，混匀后4小时内观察结果；鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸和氨基酸质控品应覆盖无菌液体石蜡。

三。结果摘要

TCBS上的霍乱弧菌呈圆形、光滑、黄色，直径2mm ~ 3mm在庆大霉素琼脂培养基上，略呈青灰色，半透明，扁平，略凸起，如延长培养或室温，菌落中央有黑色金属碲沉淀；氯化钠三糖铁斜面上反应，底部黄色，斜面黄色，不产生硫化氢或气体。纯化后在氯化钠营养琼脂培养基上培养，菌落呈圆形，边缘半透明，中心不透明，直径约3mm；革兰氏染色试验鉴定为革兰氏阴性，呈弧形或弧形；在氧化酶试纸上呈紫色，为阳性实验结果；在无盐蛋白胨水和2%氯化钠蛋白胨水中生长；6%氯化钠蛋白胨水、8%氯化钠蛋白胨水和10%氯化钠蛋白胨水生长不旺盛。ONPG是积极的；脲酶阴性；明胶呈阳性；鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶阳性；氨基酸对照和精氨酸为阴性；蔗糖和甘露醇呈阳性；乳糖、纤维二糖和阿拉伯糖为阴性；靛蓝基质试验呈阳性；在42℃的恒温培养箱中生长。除上述试验外，霍乱弧菌的检测还可作为血清学分型及其他相关试验。

目前上述的内容应该能够为大家解答出大家对于霍乱是什么(霍乱是人型的还是鼠型的)的疑惑了，所以如果大家还想要了解更多的知识内容，也可以关注本站其他文章进行了解哦。

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